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    本文揭示以LIN28B基因或其變異型作為癌幹細胞標記基因，其可用於診斷、治療惡性腫瘤(如肝癌)或評估預後。據此，本文多種實施方式中揭示用以偵測個體內循環性癌幹細胞的方法與套組，其係使用LIN28B基因或其變異型作為癌幹細胞標記基因。
    公开号:TW201319258A
    申请号:TW101141693
    申请日:2012-11-08
    公开日:2013-05-16
    发明作者:Chung-Liang Ho
    申请人:Univ Nat Cheng Kung；
    IPC主号:G01N33-00
    专利说明:
    用以偵測循環性癌幹細胞的方法與套組
    本發明是有關於癌症診斷，且特別是有關於用以偵測循環性癌幹細胞(circulating cancer stem cell，簡稱CCSC)以供後續臨床分析的方法與套組。
    肝癌(hepatocellular carcinoma，簡稱HCC)是全球排名第五的常見實性(solid)惡性腫瘤，名列癌症相關死因的第三名。肝癌主要肇因於患者的肝臟發炎，造成發炎的原因可能是肝炎病毒(如B型或C型肝炎病毒)感染，或代謝疾病或毒物(如酒精或黃麴毒素B1)侵害。肝癌的治療方案主要取決於診斷時腫瘤生長的狀態以及預期的臨床結果。因此，若能提供可做為肝癌診斷和/或預後分析的生物標記，將非常有用。
    用於肝癌診斷的標記有甲型胎兒蛋白(alpha-fetal protein，簡稱AFP)基因與聚醣蛋白-3(glypican-3，簡稱GPC3)基因。AFP與GPC3基因皆為腫瘤胚(oncofetal)基因，因為這些基因會在早期胚胎發生過程中大量表現，之後在大多數的成體細胞中則不會表現，但在癌細胞中，此類腫瘤胚基因又會再度啟動。由於此種腫瘤胚基因/蛋白質在成體內的背景表現量非常低，很適合作為腫瘤標記。
    癌幹細胞(cancer stem cell，CSC)又稱腫瘤幹細胞(tumor stem cell，TSC)，是一種獨特的癌細胞類型，其具有自我更新的能力，且可透過分化而產生多種癌細胞株。癌幹細胞存在於多種惡性腫瘤內，包括白血病、腦癌、乳癌、結腸直腸癌、卵巢癌、胰臟癌、前列腺癌與肝癌；這些研究結果也是目前癌幹細胞理論的發展基礎。根據癌幹細胞理論，腫瘤組織(neoplasms)就和其他身體組織一樣，可能具有層級化的架構，而癌幹細胞正位於此種細胞層級的頂端。所以，目前認為癌幹細胞能夠再現腫瘤新生的過程，而重新形成一個能夠持續生長的腫瘤。目前為止，可利用多種細胞表面抗原，來偵測肝癌的癌幹細胞，所述的細胞表面抗原如c-kit、CD133、CD90、CD44、OV6與CD326(即表皮細胞黏著分子(epithelial cell adhesion molecule)，簡稱EpCAM)。
    在許多當前人類惡性腫瘤的診斷和治療領域中，都希望能夠偵測或識別癌幹細胞。然而，由於癌幹細胞僅佔整體腫瘤組織中極小一部份，通常需耗費許多人力以及高度的操作技巧方能偵測或識別癌幹細。更有甚者，為了提高癌幹細胞的偵測機率，通常會在腫瘤病灶部位以侵入性方式進行取樣，對患者與臨床診治較為不利。
    有鑑於此，相關領域亟需一種新穎的標記與方法，以偵測或識別癌幹細胞。此外，在較佳的情形中，可運用侵入性最小的方式來偵測所述標記。此類標記與偵測方法對於惡性腫瘤的診斷、治療和/或預後評估是一種理想的工具。
    發明內容旨在提供本揭示內容的簡化摘要，以使閱讀者對本揭示內容具備基本的理解。此發明內容並非本揭示內容的完整概述，且其用意並非在指出本發明實施例的重要/關鍵元件或界定本發明的範圍。發明內容旨在提供本揭示內容的簡化摘要，以使閱讀者對本揭示內容具備基本的理解。此發明內容並非本揭示內容的完整概述，且其用意並非在指出本發明實施例的重要/關鍵元件或界定本發明的範圍。
    本發明之一態樣是關於用以偵測個體內是否帶有循環性癌幹細胞的方法。舉例來說，循環性癌幹細胞係源自於肝癌細胞。根據本發明的原理與精神，此方法採用取自或衍生自體液的樣本，因而屬於非侵入性或最小侵入性的技術。本方法的另一優點在於提出了一種新穎的癌幹細胞標記基因，即Lin-28同源B基因(Lin28 homolog B gene，簡稱LIN28B基因)或其變異型。此外，本方法的偵測敏感度高，因此能夠定性與定量地識別或偵測循環性癌幹細胞，即便此種循環性癌幹細胞在個體體液中的數量非常稀少
    依據本發明一實施方式，此方法包含以下步驟。首先，自所述個體取得一體液樣本。其後，由該體液樣本分離出複數個單核細胞。之後，利用聚合酶連鎖反應(polymerase chain reaction，簡稱PCR)式方法來決定該些單核細胞內是否有LIN28B基因的表現。當偵測到LIN28B基因的表現時，代表此體液樣本帶有循環癌幹細胞；而當無法偵測到LIN218B基因表現時，代表此體液樣本不帶有循環癌幹細胞。
    於此實施方式中，所述的癌幹細胞標記基因為LIN28B基因或其變異型。舉例來說，此LIN28B基因或其變異型的序列和序列編號：6所示序列具有至少80%的核酸序列相似度。此外，所述LIN28B基因或其變異型的序列和序列編號：6所示序列具有至少90%的核酸序列相似度。較佳地，該LIN28B基因或其變異型的序列和序列編號：6所示序列具有至少95%的核酸序列相似度。更佳地，此LIN28B基因或其變異型的序列和序列編號：6所示序列具有至少98%的核酸序列相似度。於一實施例中，該癌幹細胞標記基因的序列與序列編號：6所示序列完全相同。
    於某些可任選的實施方式中，所述個體經診斷罹患肝癌時，此時所述方法更包含一評估步驟，以決定此個體的術後預後。於此情形中，若體液樣本帶有循環癌幹細胞，代表該個體的術後預後較差；而若體液樣本不帶有循環癌幹細胞，代表該個體的術後預後較佳。舉例來說，所謂較佳的術後預後係指該個體的無復發存活期(recurrence-free survival，簡稱RFS)大於等於12個月；而不佳的術後預後則代表該個體的無復發存活期小於12個月。
    當可理解，所述的體液樣本係取自於該個體的體液。相較於傳統技術需由腫瘤病灶部位取得組織樣本，此種體液樣本的取樣過程侵入性較低。根據本領域慣常的操作方式，可直接使用所取得的體液樣本或先經過適當處理後，再進行後續分析。根據本發明多種實施方式，體液樣本係取自或衍生自至少一種下列體液：周邊血(peripheral blood)、肋膜腔積液(pleural effusion)、腹水(ascites)、腦脊髓液(cerebrospinal fluid)、淋巴液(lymphatic fluid)與骨髓液(bone marrow fluid)。
    根據某些實施方式，可利用密度梯度(density gradient)技術來分離上述單核細胞。在一些較佳的實施方式中，於分離該些單核細胞時並未使用對循環性癌幹細胞之抗原決定位具專一性的抗體。
    在某些實施方式中，上述PCR式的方法可為反轉錄PCR(reverse transcription PCR，簡稱RT-PCR)或定量即時反轉錄PCR(quantitative real-time RT-PCR，簡稱RQ-PCR)，包含雙重(duplex)RQ-PCR與多重或複合式(multiplex)RQ-PCR。
    於某些實施方式中，上述的PCR式方法(如RT-PCR)使用的正向引子序列如序列編號：1所示，而所用的反向引子序列如序列編號：2所示。
    在替代性的實施方式中，所述PCR式方法(如RQ-PCR)使用第一引子對以供擴增所述癌幹細胞標記基因。於一實施例中，第一引子對包含正向引子(如序列編號：3所示)與反向引子(如序列編號：4所示)。可任選地，上述RQ-PCR技術更使用了第一螢光標記探針，用以偵測經擴增產物的存在。舉例來說，第一螢光標記探針的序列如序列編號：5所示。
    於RQ-PCR處理中，可決定癌幹細胞標記基因的循環閾值(cycle threshold，簡記為CtCSC值)，並根據此一CtCSC值來判定樣本中是否有癌幹細胞標記基因的表現。根據本發明某些實施方式，當CtCSC值小於38且大於0時，代表體液樣本中有癌幹細胞標記基因的表現；而當CtCSC值大於等於38或無法決定CtCSC值(即，無CtCSC值)時，代表體液樣本中沒有癌幹細胞標記基因的表現。
    於某些實施方式中，所述個體經診斷罹患肝癌。此時所述方法更包含以下步驟：分別決定癌幹細胞標記基因的拷貝數(CpCSC)以及管家基因的拷貝數(CpHK)；並根據方程式(1)計算此癌幹細胞標記基因相對於所述管家基因的相對表現分數：相對表現分數=log(CpCSC/CpHK) 方程式(1)。之後，將計算所得之相對表現分數和預定的門檻值做比較。當相對表現分數大於等於此門檻值時，判定該個體的可能有較差的術後預後。當相對表現分數小於此門檻值時，則判定該個體的可能有較佳的術後預後。
    根據本說明書多種實施方式，所述的管家基因可為編碼β-肌動蛋白(β-actin)的ACTB基因，或者是可為編碼3-磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)的GAPDH基因。當以GAPDH基因作為管加基因時，所述的RQ-PCR處理更包含使用第二引子對來擴增GAPDH基因。於一實施例中，第二引子對包含如序列編號：8所示的正向引子以及如序列編號：9所示的反向引子。此外，RQ-PCR處理亦可任選地包含第二螢光標記探針(譬如，如序列編號：10所示的探針)以偵測經擴增的GAPDH產物。
    於某些實施方式中，係針對GAPDH來計算相對表現分數。此時，若個體經診斷罹患肝癌，當所得相對表現分數大於等於-3，代表該個體的術後疾病特定存活期(disease-specific survival，簡稱DSS)不佳；當所得相對表現分數小於-3，代表該個體的術後預後疾病特定存活期較佳。
    根據某些實施方式，所述方法能夠由約一千萬(107)個單核細胞中偵測出1個循環性幹細胞的存在。
    於另一態樣中，本發明提出了一種套組，其可用以偵測個體體內的循環性癌幹細胞。此套組可用以識別癌幹細胞標記基因-LIN28B或其變異型。
    根據本發明某些實施方式，所述套組包含第一引子對，用以擴增癌幹細胞標記基因。該第一引子對包含一正向引子與一反向引子，這些引子能夠專一性地與一癌幹細胞標記基因雜合。更明確地說，每一正向與反向引子分別包含15至30個連續的核苷酸，其與序列編號：6所示序列的15至30個連續核苷酸互補。
    於某些實施方式中，正向引子的序列如序列編號：1所示，且反向引子的序列如序列編號：2所示。
    或者是，於某些實施方式中，正向引子的序列如序列編號：3所示，且反向引子的序列如序列編號：4所示。於此類實施方式中，所述套組更包含一可任選的螢光標記探針，以偵測癌幹細胞的擴增產物，此探針的序列如序列編號：5所示。可任選地，此套組可更包含第二引子對，以擴增管加基因(如，ACTB基因或GAPDH基因)。於一實施例中，所述的第二引子對包含如序列編號：8所示的正向引子以及如序列編號：9所示的反向引子。此套組可更包含一可任選的螢光標記探針(如序列編號：10所示)，以偵測GAPDH的擴增產物。
    在參閱下文實施方式後，本發明所屬技術領域中具有通常知識者當可輕易瞭解本發明之基本精神及其他發明目的，以及本發明所採用之技術手段與實施態樣。
    為了使本揭示內容的敘述更加詳盡與完備，下文針對了本發明的實施態樣與具體實施例提出了說明性的描述；但這並非實施或運用本發明具體實施例的唯一形式。實施方式中涵蓋了多個具體實施例的特徵以及用以建構與操作這些具體實施例的方法步驟與其順序。然而，亦可利用其他具體實施例來達成相同或均等的功能與步驟順序。
    除非本說明書另有定義，此處所用的科學與技術詞彙之含義與本發明所屬技術領域中具有通常知識者所理解與慣用的意義相同。此外，在不和上下文衝突的情形下，本說明書所用的單數名詞涵蓋該名詞的複數型；而所用的複數名詞時亦涵蓋該名詞的單數型。
    雖然用以界定本發明較廣範圍的數值範圍與參數界是約略的數值，此處已盡可能精確地呈現具體實施例中的相關數值。然而，任何數值本質上不可避免地含有因個別測試方法所致的標準偏差。在此處，「約」通常係指實際數值在一特定數值或範圍的正負10%、5%、1%或0.5%之內。或者是，「約」一詞代表實際數值落在平均值的可接受標準誤差之內，視本發明所屬技術領域中具有通常知識者的考量而定。除了實驗例之外，或除非另有明確的說明，當可理解此處所用的所有範圍、數量、數值與百分比(例如用以描述材料用量、時間長短、溫度、操作條件、數量比例及其他相似者)均經過「約」的修飾。因此，除非另有相反的說明，本說明書與附隨申請專利範圍所揭示的數值參數皆為約略的數值，且可視需求而更動。至少應將這些數值參數理解為所指出的有效位數與套用一般進位法所得到的數值。
    於本說明書中，交替使用「癌」(cancer)、「腫瘤」(tumor)與「惡性腫瘤」(malignant tumor)等詞彙來指稱發生於哺乳動物體內由異常細胞生長所導致的特殊生理狀況。「肝癌」(hepatocellular carcinoma，簡稱HCC)則是指由肝臟細胞發展出來的癌症，此種肝癌和其他肝臟性癌症(hepatic cancer)不同，後者涵蓋了各種肝轉移癌症(liver metastases)。
    在此處，「個體」(subject)或「患者、病患」(patient)係指任何適當的動物，包含人類。較佳地，所述個體或患者經診斷罹患癌症(如肝癌)，且適用於此處提出之方法。除非另有說明，「個體」或「病患」、「患者」等詞包含了雄性與雌性。
    於本說明書中，「體液樣本」(body fluid sample)一詞係指任何分離自或取自一動物之體液的樣本。較佳地，所述動物為人類。根據本發明某些實施方式，所述體液樣本包含取自需接受醫學處置之個體的臨床樣本。
    在此處，基因的「表現量」(expression level)係指透過定性或定量的方法來決定該基因的表現產物(expression product；或稱基因產物)。「表現產物」或「基因產物」等詞在此係指一基因經轉錄所得之RNA產物(又稱轉錄體(transcripts))；以及此種RNA轉錄體經轉譯的多胜肽產物。舉例來說，表現產物可為未剪接(unspliced)RNA、信息RNA(mRNA)、mRNA的剪接變異體(splicing variant)、微RNA(microRNA，簡稱miRNA)、片段(fragmented)RNA、多胜肽、經轉譯後修飾(post-translationally modified)的多胜肽、多胜肽的剪接變異體等。因而，所述的基因表現量可以是指該基因的RNA表現量或多胜肽表現量。此外，所述表現量可為絕對表現量或相對表現量。根據本發明某些實施方式，所述相對表現量是「標準化」(normalized)的表現量，其中將標記基因的表現量相對於至少一種管家基因(即參考基因)進行標準化。舉例來說，上述管家基因的表現產物可以是樣本中所有測量到的表現產物、單一種參考表現產物或一組特定的表現產物。
    此處所述的核酸「序列」(sequence)係指組成一核酸的核苷酸之排序。在本說明書中，核酸具有5'端與3'端；除非另有說明，單股核苷酸序列的左手端為5'端；而右手端為3'端。「下游」(downstream)一詞係指位於所述核苷酸序列之3'方向的一核苷酸序列；而「上游」(upstream)一詞則是指位於所述核苷酸序列之5'方向的一核苷酸序列。
    此處針對核苷酸序列序列所述的「序列相似度百分比」(percentage(%)sequence identity)係指該候選核苷酸序列之核苷酸殘基與一參考核酸序列之核苷酸殘基完全相同的百分比。於進行上述比對時，可將該候選核苷酸序列與該參考核苷酸序列並排，並於必要時引入間隙，以使二序列形成最高的序列相似度，且在計算相似度時，並未將保守性置換之核苷酸殘基納入考量。相關領域已有多種方法可供進行上述並排，譬如可公開取得的軟體如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)等。本發明所屬技術領域中具有通常知識者在進行並排時，可選擇適當的參數與計算方式，以得到最佳的排列方式。在本說明書中，二核苷酸序列間的序列比較是採用美國國家生物科技資訊中心(Nation Center for Biotechnology Information，簡稱NCBI)所提供的核苷酸-核苷酸BLAST分析軟體Blastn來進行。一特定核苷酸序列A相較於一參考核苷酸序列B的核苷酸序列相似度(在本說明書中亦稱之為序列A與序列B具有特定百分比(%)的核苷酸序列相似度)的計算方式如下： 其中X是利用Blastp軟體對序列A、B進行排列後所得到的相同核苷酸殘基數目(identical matches)，而Y是A、B二序列中較短者的核苷酸殘基總數。
    於本說明書中，「預後」(prognosis)一詞係指預測癌症患者出現與癌症相關的死亡或疾病進展的可能性。譬如出現腫瘤(如，肝癌)的復發(recurrence)、轉移性擴散(metastatic spread)與抗藥性。當可理解，「預後」並非指能夠百分之百準確地預測一病症的進程或結果的能力。相反地，本發明所述技術領域中具有通常知識者當可理解，「預後」一詞係指某一進程或結果可能發生的機率較高；亦即，在個體符合特定情況(如，帶有癌幹細胞)的前提下，一特定進程或結果較有可能發生(相較於不符合此種情況的個體)。通常在評估預後時，會考量與較佳或較差的疾病進程或結果相關的因素或病徵。有多種方式可用來表示患者的預後，譬如：總存活期(overall survival，簡稱OS)、無復發存活期(RFS)和/或疾病特定存活期(DSS)等。總存活期係指由診斷或治療起，到死亡為止的時間。疾病特定存活期則是指由完全緩解(complete remission)到因為肝癌而死亡為止的時間；而無復發存活期是指由完全緩解到肝癌復發或因任何理由死亡(以先發生的為準)為止的時間。
    在此處，「較佳預後」(favorable prognosis)一詞係指針對一肝癌患者所決定的預後優於(即，結果較佳)針對一名或一群罹患相同疾病之參考患者所決定的預後。舉例來說，相較於參考患者，預後較佳的患者可望具有較長的總存活期或無復發存活期。相反地「較差預後」(unfavorable prognosis)一詞係指針對一肝癌患者所決定的預後比起針對一名或一群罹患相同疾病之參考患者所決定的預後來得差。舉例來說，相較於參考患者，預後較差的患者可望具有較短的總存活期或無復發存活期。
    「引子」(primer)一詞在此係指一單股核苷酸序列，當引子處於適當的環境(如具有適當緩衝液、鹽類、溫度和/或pH值)下且環境中存有核苷酸以及用於核酸聚合的成分(如，DNA聚合酶(DNA-dependent polymerase)或RNA聚合酶RNA-dependent polymerase)時，引子能夠作為一引子延長產物的合成起始點。
    本說明書率先揭示LIN28B基因是可靠的癌幹細胞標記。至少部分基於此一發現，本說明書提出一種用以識別癌細胞中一種罕見次族群-循環性癌幹細胞的方法。
    Lin-28是一種RNA結合蛋白質，此蛋白質首次是自線蟲(Caenorhabditis elegans)體內分離出來，是生物體發展時機(developmental timing)的重要調節因子。線蟲lin-28基因在人體內的同源物(包括LIN28(亦稱為Lin-28同源物A，簡稱LIN28A)與LIN28B基因)可和let-7家族miRNA前驅物的末端環(terminal loop)結合，並使得這些前驅物無法經處理成為成熟的miRNA。先前的研究顯示LIN28B具有腫瘤胚表現模式，意味著此基因在胚胎發生階段會大量表現，且在大多數的成體組織中不會表現，但在癌細胞中又會重新啟動。此外，研究指出在肝癌患者中，會表現LIN28B的腫瘤通常和較後期的癌症階段與較差的臨床結果(譬如早期復發的比例明顯較高)相關。然而，並非所有腫瘤胚基因都涉及了保持癌幹細胞之幹細胞特性的過程。本案發明人所進行的實驗(如下所述)顯示LIN28B基因的大量表現與人類肝癌細胞株之幹細胞特性提升相關。基於此一發現，LIN28B基因可作為一種自肝癌細胞中識別出癌幹細胞的標記。
    此外，本發明提出的方法並非使用傳統自腫瘤組織中偵測癌幹細胞的方法；相反地，此處提出的方法是由個體的循環體液中偵測出癌幹細胞。循環性腫瘤細胞(circulating tumor cell，簡稱CTC)或循環性癌細胞是指由原發腫瘤(primary tumor)脫離而進入血液循環系統的細胞。簡言之，在腫瘤發生過程的早期，腫瘤細胞可能會侵襲鄰近的血管或新生微血管。這些腫瘤細胞通常帶有CD8抗原，此種抗原有細胞毒性，且因而會被免疫系統視為外來物。所以天然殺手(natural killer，簡稱NK)細胞會攻擊這些腫瘤細胞，因而使得腫瘤細胞在循環系統中的累積受到壓抑。然而，某些腫瘤細胞(譬如團聚的惡性腫瘤細胞)可能會逃過這種免疫機制，而成為循環性腫瘤細胞。目前用以偵測循環性腫瘤細胞的方法多數使用複雜的免疫分析方法(譬如CTC-chipTM或CellSearchTM)，利用一或多種專一性的抗體來偵測一或多種上皮細胞表面標記(如EpCAMs)；或者是採用多次的定量PCR(multiplex qPCR)方法來偵測與腫瘤相關的mRNAs。上述傳統技術的偵測極限約可自1毫升的全血中偵測出1至10個循環性腫瘤細胞。然而，癌幹細胞僅佔總體腫瘤質量的極小部分(約0.01-2%)；故當可想見，在循環性體液中，相對於大量的體液細胞，循環性癌幹細胞所佔的比例勢必比循環腫瘤細胞更少。因而，需要新穎的偵測技術來偵測此種含量極低的循環性癌幹細胞。本發明發現了一種全新的幹細胞標記-LIN28B基因，因而克服了先前技術的缺失。本發明提出的方法提供了一種可靠的偵測方法，能夠識別肝癌患者體內是否具有可偵測到的循環性癌幹細胞。此一辨識結果可作為診斷、治療和/或預後評估的工具。下文實驗例所進行的驗證分析確認了本發明在「利用是否具有循環性幹細胞來分類肝癌患者」這方面的有效性與準確度。
    有鑑於上述討論，本發明之一態樣是關於以Lin-28B基因或其變異型作為癌幹細胞標記基因的新穎用途。基於此一用途，本發明的另一態樣提出了一種識別個體內是否有循環性癌幹細胞的方法。根據本說明書多種實施方式，上述方法包含取樣步驟、分離步驟與決定步驟；茲分述如下。
    於取樣步驟中，由個體取得體液樣本。根據本發明多種實施方式，體液樣本係取自或衍生自至少一種下述體液：周邊血、肋膜腔積液、腹水、腦脊髓液、淋巴液與骨髓液。於下文提出的實驗例中，所述體液樣本係取自肝癌患者或其他個體的全血(whole blood)樣本。當可理解，相較於先前技術需自可能位於患者體內深處的腫瘤部位取得組織樣本，本實施方式提出的取樣過程侵入性較低。此處可利用慣用的抽血技術，自個體收集全血。根據慣常的操作手段，可直接利用取自個體的體液樣本；或在將其用於後續分析之前，先進行初步處理，譬如離心、沈降等。
    接著，在分離步驟中，將複數個單核細胞自體液樣本中分離出來。當可理解，體液樣本可能含有各種類型的細胞、胞器與次細胞成分。分離步驟的目的在於提升用於後續分析之目標族群的比例。在此處，上述目標族群是循環性癌幹細胞，此類細胞與白血球同樣屬於單核(mononuclear)細胞。因而，任何可將這些單核細胞和體液樣本中其他成分分離的技術，皆適用於本方法。
    根據本說明書多種實施方式，可利用密度梯度分離技術來分離該些單核細胞，此技術使用特殊的介質來分離細胞、胞器與次細胞成分。譬如Ficoll®就是一種常用的密度梯度介質，這是一種合成的高分子量蔗糖聚合物。長久以來，Ficoll®就應用於分離白血球與血液中其他成分。
    傳統的循環性癌幹細胞之偵測方法除了上述密度梯度分離技術之外，通常會搭配使用一或多種上皮細胞表面標記的抗體，以進一步增加樣本中目標細胞的濃度。然而，此類以免疫反應為基礎的方法通常需耗費大量人力，且需要較高的操作技巧。相較之下，本發明提出的方法由於偵測敏感度較佳(可於每107個單核細胞中偵測出1個循環性癌細胞)，因而不需使用這種對標記具有專一性之抗體。因此，於某些實施方式中，於分離該些單核細胞時，不會使用對循環性癌幹細胞之抗原決定位具有單一性的抗體。
    於分離步驟之後，本方法接著進行決定步驟，此步驟利用PCR式的方法來決定癌幹細胞標記基因在這些單核細胞內是否表現。根據本發明多種實施方式，偵測到癌幹細胞標記基因的表現，代表體液樣本中帶有循環癌幹細胞；而當無法偵測到癌幹細胞標記基因的表現時，代表體液樣本中不帶有循環癌幹細胞。
    根據本說明書多種實施方式，癌幹細胞標記基因為LIN28B基因或其變異型。舉例來說，LIN28B基因或其變異型的序列和序列編號：6所示序列具有至少80%的核酸序列相似度。具體來說，所述的癌幹細胞標記基因之核酸序列與序列編號：6所示序列有80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%的序列相似度。
    於某些可任選的實施方式中，所述方法更包含一評估步驟。具體來說，此類實施方式適用於所述個體經診斷罹患肝癌的情形。於此情形中，若體液樣本帶有循環癌幹細胞，代表該個體的術後預後較差；而若體液樣本不帶有循環癌幹細胞，代表該個體的術後預後較佳。舉例來說，所謂較佳的術後預後係指該個體的無復發存活期大於等於12個月；而不佳的術後預後則代表該個體的無復發存活期小於12個月。
    根據某些實施方式，所述的PCR式方法可為反轉錄PCR(RT-PCR)或定量即時反轉錄PCR(RQ-PCR)。這些PCR式方法通常會使用多個引子來擴增一目標序列，而在設計這些引子時，會考量欲擴增的序列以及其他會影響該方法之專一性與靈敏度的因素。此種設計邏輯為本領域所述技術人員所熟知的技巧，故於此不再贅述。
    一般來說，引子的序列和欲複製的核酸股需有足夠的互補性，或該引子至少包含具有足夠互補性的一區段，以使引子可和目標序列黏合，並可自該引子的5'端向3'的方向延伸。在較佳的情形中，所述黏合係在嚴格雜合條件(stringent hybridization condition)下發生，此條件使得所述引子可和目標核酸(如LIN28B基因或其變異型的片段)雜合。所述引子可為DNA引子、RNA引子、或嵌合DNA/RNA引子。引子通常(但並非必然)為短的合成核酸，長度約為12-100個核苷酸，較佳為15-30個核苷酸。
    於某些實施方式中，上述PCR式方法為RT-PCR，其使用的正向引子序列如序列編號：1所示，且反向引子序列如序列編號：2所示。
    在某些替代性實施方式中，上述PCR式方法為RQ-PCR，其所用的正向引子序列如序列編號：3所示，且反向引子序列如序列編號：4所示；此外更使用了一種螢光標記探針，其序列如序列編號：5所示。於此情形中，上述的RQ-PCR處理包含定量該些單核細胞內癌幹細胞標記基因的表現量，以得到此癌幹細胞標記基因的循環閾值(CtCSC)。其後，將此CtCSC值和一預定數值相比較，以判定該些單核細胞內是否有癌幹細胞標記基因的表現。
    由下文所述實驗例可以確知，以38作為預定數值能夠得到具有決定性的結果。當CtCSC值小於38且大於0時，代表單核細胞(以及取自該個體的體液樣本)內帶有癌幹細胞標記基因的表現產物；因此，該樣本內含有癌幹細胞。而當CtCSC值大於等於38或由RQ-PCR處理無法得到CtCSC值時，代表單核細胞(以及取自該個體的體液樣本)內不帶有癌幹細胞標記基因的表現產物；因此，該樣本內不含有癌幹細胞。由下文的驗證分析可以發現，利用這種分群方式所得到的個體子群間，在臨床結果上的差異具有統計上的顯著性。因此，所述的方法能夠可靠地預測疾病結果，因而可針對患者給予個人化醫療，或作為選擇適當治療處置的指引。
    於某些實施方式中，此方法更包含標準化步驟，已將癌幹細胞標記基因的表現量，相對於資管家基因的表現量進行標準化。舉例來說，可利用RQ-PCR處理定量癌幹細胞標記基因與管家基因的表現量，以分別得到兩者的拷貝數(CpCSC與CpHK)。之後，根據方程式(1)來計算癌幹細胞標記基因相對於管家基因的相對表現分數：相對表現分數=log(CpCSC/CpHK) 方程式(1)。其後，將計算所得之相對表現分數和預定的門檻值做比較。當相對表現分數大於等於此門檻值時，判定該個體的可能有較差的術後預後。當相對表現分數小於此門檻值時，則判定該個體的可能有較佳的術後預後。
    管家基因是指在一物體內，不論在正常(健康)或罹病生理條件下，於特定或所有細胞類型中都會穩定表現的基因。根據本說明書多種實施方式，管家基因可以是編碼β-肌動蛋白的ACTB基因或是編碼3-磷酸甘油醛脫氫酶的GAPDH基因。
    於某些實施方式中，以GAPDH作為管家基因，且當相對表現分數大於等於-3時，代表肝癌患者的疾病特定存活期(DSS)預後不佳；而當相對表現分數小於-3時，代表肝癌患者的DSS較佳。
    根據某些實施方式，本方法能夠自約一千萬(107)個單核細胞中偵測出1個循環性癌細胞。本案藉由使用新穎的癌幹細胞標記(即LIN28B基因)，而達到此種較佳的偵測極限。
    於另一態樣中，本發明係關於一種用以偵測各體內循環性癌幹細胞的套組。此套組主要用以識別癌幹細胞標記基因-LIN28B或其變異型。
    根據本發明某些實施方式，上述套組包含第一引子對。上述第一引子對包含正向引子與反向引子，其能夠專一性地與一癌幹細胞標記基因雜合。更明確地說，正向與反向引子分別包含15至30個連續的核苷酸，其與序列編號6所示序列中的15至30個連續核苷酸相同或互補。
    於某些實施方式中，正向引子的序列如序列編號：1所示，且反向引子的序列如序列編號：2所示。
    根據某些實施方式，正向引子的序列如序列編號：3所示，且反向引子的序列如序列編號：4所示。於本實施方式中，所述套組可更包含第一探針，能夠與利用該第一引子對所得之擴增產物專一雜合。舉例來說，上述第一探針可為螢光TaqMan探針，其序列如序列編號：5所示。
    於某些可任選的實施方式中，所述套組更包含第二引子對，其包含正向引子與反向引子而能夠專一性地與一管家基因(如ACTB或GAPDH基因)雜合。譬如，當管家基因為GAPDH基因時，所述正向引子的序列如序列編號：8所示，且反向引子的序列如序列編號：9所示。此時，所述套組可更包含第二探針，能夠與經擴增的GAPDH產物專一雜合。舉例來說，上述第二探針可為螢光TaqMan探針，其序列如序列編號：10所示
    下文提出多個實驗例來說明本發明的某些態樣，以利本發明所屬技術領域中具有通常知識者實作本發明。不應將這些實施例視為對本發明範圍的限制。據信習知技藝者在閱讀了此處提出的說明後，可在不需過度解讀的情形下，完整利用並實踐本發明。此處所引用的所有公開文獻，其全文皆視為本說明書的一部分。 實驗例材料與方法<材料>
    DMEM培養基(Dulbecco’s modified Eagle’s medium)、胎牛血清(fetal bovine serum，簡稱FBS)、青黴素、鏈黴素與TRIzol皆購自Life Technologies(Carlsbad,CF)。EDTA-K3購自Becton Dickinson(Franklin Lakes,NJ)。Ficoll-Hypaque密度梯度(Histopaque-1077)購自Sigma-Aldrich(Taufkirchen,Germany)。紅血球溶解緩衝液(Erythrocyte lysis buffer)、RNA純化套組(QIAamp RNA Blood Mini Kit)與不含核糖核酸酶的去氧核糖核酸酶I(RNase-Free DNase I)係購自QIAGEN(Santa Clarita,CA)。核糖核酸酶抑制劑(RNaseOUT RNase inhibitor)、反轉錄酶(SuperScript II Reverse Transcriptase)與Hoechst 33342染料係購自Invitrogen(Carlsbad,CA)。 <病患招募與臨床資料>
    周邊血樣本來自於國立成功大學附設醫院所招募(台南，台灣)的自願者。根據國立成功大學附設醫院人體試驗及倫理委員會的許可，自2006年1月至2011年12月為止，共招募了156名自願者，並取得患者的告知後同意書。在156名患者中，有96名經診斷罹患原發肝癌，並於國立成功大學附設醫院接受肝臟切除手術，於手術前取得這些患者的全血樣本。另外招募了60名未罹患肝癌(非肝癌組)的自願者，包括31名未罹患任何肝臟疾病的健康自願者(健康組)，以及29名罹患病毒性肝炎的患者(肝炎組)。在肝炎組中，有16名患者感染了B型肝炎病毒，有13名患者感染了C型肝炎病毒；這29名患者中有8名出現肝硬化症狀。
    利用常用的技術如電腦斷層掃瞄(computed tomography，簡稱CT)或核磁共振顯影(magnetic resonance imaging，簡稱MRI)，並參考血清AFP含量是否提升或其他病理學分析，來記錄患者是否肝癌復發。無復發存活期(RFS)的定義為自手術起至首次發現有局部或遠端復發為止的期間。疾病特定存活期(DSS)則定義為自手術起至因肝癌死亡的期間。 <周邊血樣本處理>
    利用內含K3EDTA(0.12 ml；15%)的10毫升無熱原(pyrogen-free)管來收集病患的全血樣本。其後將血液樣本加入等體積的Ficoll-Hypaque密度梯度介質；在25℃下以1600 rpm離心30至40分鐘之後，由層間(interphase)收集周邊血單核細胞(peripheral blood mononuclear cell，簡稱PBMC)。接著以PBS沖洗PBMC兩次，並在25℃下以1500 rpm離心5分鐘。若樣本體積小於3 ml，以5倍樣本體積的紅血球溶解緩衝液在4℃下處理5分鐘。收集細胞沈澱物後儲存於-70℃，以供後續RNA萃取。 <萃取RNA與PCR擴增>
    利用Trizol試劑自細胞內萃取出總RNA，之後根據製造商的指示以RNA純化套組純化。
    含500 μg/ml寡核苷酸-dT引子、0.1 M DTT、40 U/μl RNaseOUT、第一鏈緩衝液(first-strand buffer)與去氧核糖核苷三磷酸鹽(dNTPs))中加入2 μg取自PBCM的全RNA與200單位的反轉錄酶，於42℃下反應50分鐘，之後加熱至72℃並保持15分鐘使反應停止，以將RNA反轉錄為cDNA。所得到的cDNA產物儲存於-20℃下。
    在RT-PCR反應中，利用Amp PCR System 9600設備(購自ABI)來擴增cDNA，反應條件如下：於95℃(2分鐘)進行單次初始變性；之後為3個循環的94℃(30秒)、63℃(30秒)、70℃(30秒)；3個循環的94℃(30秒)、61℃(30秒)、70℃(30秒)；3個循環的94℃(30秒)、59℃(30秒)、70℃(30秒)；35個循環的94℃(30秒)、58℃(30秒)、70℃(30秒)；以及於70℃(10分鐘)下進行最後延長步驟。利用含有溴化乙錠(ethidium bromide)的1.5%洋菜膠對PCR產物進行電泳分析。對GAPDG進行RT-PCR所用的引子係購自Applied Biosystems。對LIN28B進行RT-PCR所用的引子是利用設計軟體(LightCycler Probe Design Software 2.0)設計後人工合成，其序列分別是正向引子：5’-CCTTGAGTCAATACGGGT-3’(序列編號：1)；以及反向引子：5’-GCTCTGACAGTAATGGCA-3’(序列編號：2)。
    在即時定量RT-PCR(RQ-PCR)反應中，利用LightCycler system設備(購自Roche；Mannheim,Germany)來擴增2 μl的cDNA(來自少於200 ng之總RNA)並加以定量。簡言之，將cDNA樣本和0.1 μM螢光TaqMan探針、分別為0.5 μM的正向與反向引子、2 μl的反應緩衝液(LightCycler TaqMan Master，其中酵素與反應混合液的比例為1：3)以及PCR專用水(加至最終體積10 μl)加入容積為20 μl的毛細管柱內。經過離心(LC Carousel Centrifuge 2.0；購自Roche)後，利用以下條件來擴增樣本轉盤中的毛細管DNA：於95℃(10分鐘)進行單次初始變性；接著進行50個循環的變性(95℃、10秒)、黏合(55℃、30秒)與延長(72℃、5秒)；之後在40℃(30秒)下冷卻反應系統。將LIN28B表現量相對於GAPDH表現量進行標準化。
    在前期試驗中，利用商業購得的擴增套組TaqMan® Gene Expression Assays(購自)分別擴增與偵測LIN28B基因(Catalog number：Hs01013729_ml)與GAPDH基因(Catalog number：Hs99999905_ml)。此前期試驗係用以確認此處提出之方法與套組的效率與準確度。
    根據本發明實施方式，擴增與辨識LIN28B基因與GAPDH基因的RQ-PCR引子與TaqMan探針是利用引子設計軟體(LightCycler Probe Design Software 2.0)設計後人工合成，其序列如下：LIN28B正向引子：ACCCAAAGGGAAGACACTACAG(序列編號：3)；LIN28B反向引子：TTTGGCTGAGGAGGTAGACTAC(序列編號：4)；LIN28B探針：CATGATGATCAAGGCCACCACAGT(序列編號：5)；GAPDH正向引子：GAAGGTGAAGGTCGGAGTC(序列編號：8)；GAPDH反向引子：GAAGATGGTGATGGGATTTC(序列編號：9)；以及GAPDH探針：CAAGCTTCCCGTTCTCAGCCT(序列編號：10)。
    欲進行LIN28B基因GAPDH基因的絕對定量時，於取得全長cDNA後，以10的倍數由1至1,000,000倍依序稀釋。接著將稀釋的樣本分別進行RQ-PCR，並產生標準曲線。之後，在每次反應時帶入一管1,000倍的樣本作為對照組，並將待測樣本中目標序列(如LIN28B或GAPDH)的擴增結果和標準曲線相比較，以得到樣本中目標序列的絕對定量。 <製備質體與反轉錄病毒感染>
    L1N28B經擴增所得到的PCR產物以含1.5%洋菜膠進行電泳分析後，利用萃取套組(Gel/PCR Fragments Extraction Kit；購自Geneaid；汐止區，台灣)取出擴增物。將擴增物接合至pMSCVpuro載體(購自BD Clontech)以得到pMSCV-LIN28B載體，之後將載體轉型至大腸桿菌細胞(Escherichia coli Top10 competent cell)內。利用分析套組(High-Speed Plasmid Mini Kit；購自Geneaid)純化出含有目標基因的質體。為了確認插入片段是否正確，利用特定限制酶剪切質體後，接著利用洋菜膠進行電泳分析。
    人類肝臟細胞肝癌細胞株(HepG2)係購自美國菌種保存中心(American Type Culture Collection(Manassas,VA)，簡稱ATCC)；編號：HB-8065。在37℃、5%二氧化碳的條件下，將HepG2細胞培養於DMEM培養基，培養基中添加了10% FBS、100U/ml青黴素與100 mg/ml鏈黴素。於培養經轉型的HepG2細胞時，另外加入1 mg/ml的嘌呤黴素(puromycin，購自Sigma-Aldrich)，以利LIN28B基因的表現。
    細胞轉型的步驟如下。利用磷酸鈣轉型法，將pMSCVpuro與pMSCV-LIN28B載體分別和VSV-G質體共轉染至GP2-293T包裝(package)細胞內，處理時間為48小時。將HepG2細胞以每孔1×106個細胞的密度培養於直徑6公分的培養盤中，並於37℃、5%二氧化碳下培養一夜。反轉錄病毒上清液中加入8 ng/ml的凝聚胺(polybrene；購自Sigma-Aldrich)，並用以感染HepG2細胞。利用0.7μg/mL的嘌呤黴素來收集表現pMSCVpuro或pMSCV-LIN28B的HepG2細胞群。 <製備shRNA慢性病毒>
    表現小髮夾RNA(small hairpin RNA，簡稱shRNA)的pLKO.1質體係購自國家型核醣核酸干擾(RNAi)核心設施設備平台(中央研究院；台北，台灣)。慢性病毒顆粒來自國立成功大學附設醫院臨床醫學研究中心核醣核酸干擾核心實驗室。採用LIN28B之shRNA(Clone ID：TRCN0000219860；目標序列：5'-CATAACAGGTCTTCTTCATAT-3'(序列編號：6))以抑制(knock down)LIN28B的表現。使用pLKO_TRC005質體作為負對照組。 <西方墨點分析>
    利用細胞溶解緩衝液(Complete Lysis M，不含EDTA；購自Roche)來溶解收集到的細胞，之後在4℃下以10,000 x g的速度離心20分鐘。接著，利用12%的SDS-PAGE來分離蛋白質，並將其轉移到聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride membrane，購自Millipore；Billerica,MA)上。使用以下一級抗體來識別不同的蛋白質：兔抗-LIN28B(購自Cell signaling technology)；鼠抗-OCT4(購自Santa Cruz Biotechnology；Santa Cruz,CA)；兔抗-Nanog、兔抗-SOX2與兔抗-EpCAM(皆購自Epitomics；Burlingame,CA)；與鼠抗-β-肌動蛋白(購自Millipore)。 <邊緣細胞分析>
    取1×106個細胞，於37℃下加入75 mM的維拉帕米(verapamil)反應30分鐘；之後加入Hoechst 33342染料(最終濃度20 μg/mL)在黑暗中搖晃反應90分鐘，以將邊緣細胞(side population，簡稱SP)染色。 <球體形成分析>
    將細胞植於未經覆蓋的6孔培養盤(購自BD Labware；Bedford,MA)，使用不含血清的DMEM/F-12培養基，並添加1%的MEM NEAA、1X N2、20 ng/ml的EGF、10 ng/ml的bFGF、100 μg/ml的青黴素G與100 U/ml的鏈黴素(購自Invitrogen；Grand Island,NY)。培養9天候，利用倒立顯微鏡以20倍的放大倍率觀察各孔，並在光學顯微鏡下計算直徑大於50 μm之球體數目。 <統計分析>
    LIN28B表現量的標準化係將LIN28B的表現量除以同一樣本中GAPDH的表現量。利用Wilcoxon秩和檢定(rank sum test)來比較不同組別間周邊血中LIN28B之mRNA表現的差異，並利用卡方檢定(chi-square test)或費雪精確檢定(Fisher’s exact test)來探討LIN28B表現量與多種臨床病理指標的關聯。利用卡普蘭-梅爾(Kaplan-Meier)分析來計算RFS與DSS，並以對數等級檢定(log-rank test)來評估不同組別之差異的顯著性。利用單變數與多變數寇氏比例風險迴歸模型(Cox proportional hazards regression model)來決定不同預後因子間的統計顯著性。當P<0.05時，具有統計上的顯著差異。分析來自96名肝癌患者的周邊血樣本，能夠在區別率80%的情形下偵測LIN28B(+)與LIN28B(-)肝癌患者間，其風險比例為2.2。比例風險假設經平賭模式(martingale)與偏差平方和診斷圖(deviance diagnostic plots)檢驗，且並未發現明顯偏離比例風險迴歸模型假設之情形。 實驗例1 LIN28B與肝癌細胞的幹細胞特性相關
    先前的研究指出LIN28B為腫瘤胚基因，且因此本發明的目的之一在於探究LIN28B的表現模式與癌細胞的幹細胞特性之間的關係。
    首先，以表現LIN28B基因的Lin28B-pMSCV載體來將HepG2細胞株轉型(transformed)；這些經轉型的細胞經培養後，利用西方墨點法來分析多種已知的幹細胞標記。第1圖的照片為西方墨點分析的結果。相較於對照組載體(pMSCV)，可以發現在過度表現LIN28B的細胞中，多種幹細胞標記包括OCT4、SOX2、Nanog與EpCAM的表現量都受到向上調控。
    在多種固態腫瘤(包括肝癌)中，都發現到展現出似幹細胞性質的邊緣(SP)細胞。對SP細胞進行定量分析的結果顯示，LIN28B基因的過度表現會大幅提昇HepG2細胞株中邊緣細胞的數目(第2圖)。
    為了探討LIN28B對腫瘤球體形成的影響，將表現LIN28B的細胞與對照組細胞分別培養於懸浮液中，以產生球體；此種球體形成的性質可作為活體外細胞自我更新能力的指標。如第3圖所示，相較於對照組細胞，在過度表現LIN28B的HepG2細胞內，球體數目與球體尺寸都有所提升。
    上述結果顯示，提高LIN28B基因的表現確實能夠促進肝癌細胞的自我更新特性，且因而會增加這些似幹細胞之細胞的族群大小或數目。
    另一方面，本發明亦探討了向下調節LIN28B基因的表現是否會影響肝癌細胞的幹細胞特性。西方墨點分析的結果(如第4圖所示)指出抑制HepG2細胞株內LIN28B的表現會向下調控上述幹細胞標記的表現。不過，sh-對照組與sh-LIN28B組之間SP數目的差異並未達到統計上的顯著差異(P=0.240；參見第5圖)。然而，降低LIN28B基因的表現確實會抑制腫瘤球體的形成(P=0.059；參見第6圖)。
    綜觀以上實驗與分析，可以發現LIN28B基因的表現模式會影響肝癌細胞的幹細胞特性；因此，LIN28B是一種可能的癌幹細胞標記。 實驗例2肝癌細胞於正常周邊血內的活體外偵測極限
    為了決定本方法的偵測極限，將1到10萬個(105)HepG2細胞分別與含有約1千萬(107)個周邊血白血球(peripheral blood leukocyte，簡稱PBL)的取自健康捐贈者之周邊血(相當於約3 ml的全血)混合。依據上文所述的方法來進行RQ-PCR，分析結果(如第7圖所示)指出在107個PBL內可偵測到1個會表現LIN28B的HepG2細胞，樣本中有5個LIN28B之mRNA複本，且在不含HepG2細胞的正常血對照組(normal blood control，簡稱NBC)中則並未偵測到任何HepG2腫瘤細胞。此外，LIN28B之mRNA複本數目隨著肝癌細胞依序稀釋而逐漸減低。根據本實驗例，此處提出之RQ-PCR方法的偵測極限是可於約3 ml的全血中，自107個白血球中偵測到一個會表現LIN28B之HepG2細胞的存在。由於本方法能夠由數毫升的全血中偵測出一個循環性癌幹細胞的存在，本方法在臨床醫學上可作為一種最小或非侵入性的檢測方法。 實驗例3 LIN28B基因經RQ-PCR所得之標準曲線
    利用此處提出的引子與探針，根據上文所述的方法進行RQ-PCR處理，以得到LIN28B基因的標準曲線(如第8圖所示)。理論上，PCRE反應的最佳效率(efficiency)為2，亦即在每一循環中，可將每一PCR產物會複製一次。由第8圖所示之標準曲線計算所得之PCR效率為1.958，此一數值非常接近上述的最佳效率。因此，就LIN28B基因表現的定量分析而言，本發明提出了一種可靠且可再現的方法。
    再者，在樣本中含有10到106個純化質體複本時，針對LIN28B與GAPDH的定量分析的結果具有良好的線性(資料未示出)，這意味著當樣本中含有10個以上的cDNA複本時，此處提出的方法可穩定地偵測LIN28B基因與GAPDH基因。此外，當樣本含有10個cDNA複本時，利用此處之引子與探針進行RQ-PCR所得之CtCSC值約為35-36。 實驗例4 LIN28B為用以偵測循環性癌幹細胞的可能標記
    對收集自156名個體(肝癌組：96名；健康組：31名；以及肝炎組：29名)的全血樣本進行上述RQ-PCR處理，以分析樣本中循環性細胞的LIN28B表現量。6名肝癌患者的病患資料摘要整理於表1。
    第9圖摘要整理了不同群組之LIN28B表現模式。在健康組中，標準化的LIN28B表現量之平均值為1.240*10-8±2.685*10-9；且僅有一名健康個體的標準化LIN28B表現量明顯高出平均值許多。至於肝炎組，標準化的LIN28B表現量之平均值為1.421*10-8±3.935*10-9，且有兩名肝炎患者的標準化LIN28B表現量明顯高於平均值。在肝癌組中，標準化的LIN28B表現量之平均值為2.616*10-7±1.4935*10-7，且有32名肝癌患者的標準化LIN28B表現量高於或等於平均值。
    比較不同個體群組可以發現，在健康組與肝炎組之間，患者的標準化LIN28B表現量並無顯著差異(P=0.518)；然而，在肝癌組相對於健康組(P=0.001)以及肝癌組相對於肝炎組(P=0.004)之間，患者的標準化LIN28B表現量有統計上的顯著。
    基於上文實驗例2所提出的偵測極限，此處所述的方法在非肝癌對照組中偵測到3人(5%)表現出LIN28B的mRNA，其中1人來自健康組，另2人來自肝炎組；而在肝癌組中則偵測到32人(33.3%)有LIN28B的mRNA表現。如上文所述，LIN28B是腫瘤胚基因，在分化後的成體細胞內通常不表現，但在腫瘤細胞內會例外地表現；因此，本案發明人認為此處所提出之方法所偵測到的可表現LIN28B之細胞絕大多數(甚至全數)是來自癌細胞(如，肝癌細胞)。關於在健康與肝炎組內偵測到少數個體帶有可表現LIN28B之細胞，可能的解釋如下：由於肝臟發炎而新生的非惡性肝細胞脫落進入血液循環中；白血球內出現不受控制的轉錄(illegitimate transcription)；或是個體體內確實存有少量的惡性細胞。
    接著，利用偵測結果和肝癌患者的術後結果來確認LIN28B作為癌幹細胞標記在預後預測方面的價值。
    首先，根據分析時肝癌是否復發，將96名肝癌患者分成復發組與未復發組兩個子群，以探討LIN28B表現是否與肝癌復發相關。分析結果如第10圖所示，由圖中可以看出在復發組(n=40)中，標準化LIN28B表現量的平均值為2.909*10-6±3.3405*10-6，此一表現量比起未復發組(n=56)之平均值(4.684*10-8±2.475*10-8)幾乎高了兩個數量級(orders)。兩個組別間的差異具有統計上的顯著性(P<0.001)。這些結果顯示LIN28B表現量與肝癌復發成正相關。
    基於以上初步分析的結果，進行資料分析和運算，以決定一個門檻值，用以判定一樣本是否含有表現LIN28B基因的細胞。下文提出了兩種分群方法。
    於第一例中，利用絕對定量的結果來進行此種分群。此時，可將每一樣本的CtCSC值和一CtCSC門檻值相比較，當CtCSC值低於此門檻值時，判定樣本中含有表現LIN28B基因的細胞。針對多種可能的CtCSC門檻值進行驗證後，選定以38作為CtCSC門檻值，當一樣本的CtCSC值小於38且大於0時，判定該樣本為LIN28B-陽性(LIN28B-(+))樣本；而當一樣本的CtCSC值大於等於38或由RQ-PCR處理無法測得CtCSC值時，認定該樣本為LIN28B-陰性(LIN28B-(-))樣本。
    在第二例中，以相對定量的結果來進行上述分群。此時，可根據上述方程式1計算出LIN28B基因相對於GAPDH基因的相對表現分數。之後，比較不同病患群組與子群組的相對表現分數，以選定一些可能的門檻值；然後再利用臨床資料分別驗證這些門檻，以評估此門檻值應用於預測預後的價值。具體來說，健康組、肝炎組與肝癌組的相對表現分數分別為-7.9、-7.8與-6.58。將肝癌患者進一步分成未復發與復發兩個子群組，其相對表現分數分別是-7.32與-5.5。針對多種可能的分數門檻值進行驗證後，選定以-7作為分數門檻值，當一樣本的相對表現分數大於等於-7時，判定該樣本為LIN28B-陽性(LIN28B-(+))樣本；而當一樣本的相對表現分數小於-7時，判定該樣本為LIN28B-陰性(LIN28B-(-))樣本。
    根據上文選定的門檻值(如，CtCSC門檻值=38或分數門檻值=-7)將96名肝癌患者分成LIN28B-陽性與LIN28B-陰性兩個子群組之後，進一步分析了這兩個子群組患者的多種臨床病理指標。表2所示的結果係以CtCSC門檻值為38分群所得之結果。
    很明顯地，由表2可以看出循環性細胞中LIN28B的表現與無肝硬化之肝臟(P=0.021)、腫瘤等級(P=0.046)、腫瘤大小(P=0.005)與AJCC階段(P=0.044)等臨床病理指標相關。卡普蘭-梅爾分析的結果(如第11圖所示)指出個體帶有可表現LIN28B的循環性細胞與無復發存活期(RFS)顯著相關(P<0.001)。此外，在LIN28B-陽性群組中，無復發存活期的累積存活率在術後6個月內就下降至60%以下。相較之下，LIN28B-陰性群組患者在術後6個月內的無復發存活期之累積存活率仍有80%以上。以上結果顯示患者體內帶有可表現LIN28B基因的循環性細胞和6個月內的早期復發成正相關。
    根據AJCC分期進一步將肝癌患者HCC分成多個子群組，其卡普蘭-梅爾分析結果如第12圖、第13圖所示。請見第12圖，對於罹患較早期(I至II期)肝癌的患者，患者循環系統內帶有可表現LIN28B的細胞明顯地與RFS相關(P=0.003)。同樣參照第12圖，可以發現，罹患I至II期肝癌的患者中，約有40%的LIN28B-陽性患者在6受後個月內出現早期復發；而LIN28B陰性患者則只有約10%會在6個月內復發。因此，對罹患I至II期肝癌的患者來說，體內是否帶有可表現LIN28B基因之循環性細胞，與患者在6個月內肝癌復發的機率高低相關。
    然而，參見第13圖，對於罹患後期(IIIA期至IVA期)肝癌的患者，是否帶有循環性之可表現LIN28B的細胞則並未構成統計上的顯著差異(P=0.419)。於是，將第I-II子群組內的肝癌患者又更進一步分成兩個子群組(I期與II期)，其卡普蘭-梅爾分析的結果分別如第14圖與第15圖所示。由圖中可以看出，在這兩個子群組內，樣本中是否帶有可表現LIN28B的循環細胞仍舊與患者的RFS有顯著相關(肝癌I期：P=0.030；肝癌II期：P=0.030)。
    利用單變數分析來探討帶有可表現LIN28B之細胞以及其他臨床病理變因是否與「無復發存活期」(RFS)或「小於1年的無復發存活期」(RFS<1年)相關。表3中整理出的結果顯示可表現LIN28B之循環細胞(P=0.001)以及某些其他變因(譬如腫瘤等級(P=0.047)、血管侵犯(P=0.038)與AJCC分期(P<0.001))和較短的RFS有顯著的關連。
    *P<0.05。
    在多變數分析模型中，多發性腫瘤(P=0.007)、AJCC分期(P=0.001)與可表現LIN28B的循環性細胞(P=0.043)等因素皆為與較短RFS相關之獨立變因(表4)。此外，表4的資料顯示，個體帶有可表現LIN28B的循環性細胞亦與早期復發(即，RFS<1年)有顯著的統計上關聯(P=0.035)。
    如上文.所述，據信此處提出之方法所測得之可表現LIN28B的細胞絕大多數為循環性肝癌細胞。理論上，循環性癌細胞包含已分化的腫瘤細胞和/或癌幹細胞。先前的研究指出，已分化的循環性癌細胞可能欠缺或僅具備有限的擴增能力，此類細胞通常會發生細胞凋亡，而不太可能在遠端位置引發轉移性病灶；相較之下，循環性癌幹細胞能夠在轉移部位再生一整個族群的腫瘤細胞。以肝癌為例，研究認為循環性癌幹細胞可能會順著循環系統回到肝臟，並促成早期腫瘤再生。上文提出的實驗分析顯示，當個體帶有可表現LIN28B之細胞時，此一現象與較差的術後臨床結果相關。舉例來說，LIN28B-陽性患者的平均無復發存活期比起LIN28B-陰性患者來得短；此外，前者在一年內出現早期復發的比例也比後者來得高。由以上結果，連同既有理論認為只有循環性癌幹細胞(而非所有循環性癌細胞)涉及癌症轉移或肝癌復發等過程，可以推知可表現LIN28B的細胞極有可能是循環性癌幹細胞，而非經過分化的癌細胞。因而，根據本發明的原理與精神，在癌症患者的體液樣本(如，全血)中偵測到存有可表現LIN28B的細胞，意味著該個體的循環系統中帶有循環性癌幹細胞。此一資訊在惡性腫瘤(譬如肝癌)的診斷、治療和/或預後評估等方面，具有重大的意義。
    關於肝癌患者的疾病特定存活期(DSS)，多變數分析結果顯示多發腫性瘤(P=0.046)與AJCC分期(P=0.020)都是獨立的因素(資料未示出)。然而，在多變數分析中，患者體內是否帶有可表現LIN28B之循環性細胞(以上文提出的CtCSC門檻值=38或分數門檻值=-7來區分)與DSS則無顯著相關(資料未示出)。因此，於一實驗例中採用另一分數門檻值，並進行卡普蘭-梅爾分析。分析結果(如第16圖所示)顯示以相對表現分數-3作為分數門檻值將患者分組時，兩個組別間存有統計上的顯著差異。具體來說，若肝癌患者的LIN28B表現量較高(標準化的LIN28B表現量大於等於10-3)時，患者的DSS相較於LIN28B表現量較低的患者來得短(P=0.094)。此結果顯示在循環性癌幹細胞內LIN28B基因的過度表現和/或患者體內有大量循環性癌幹細胞的存在，可能與較短的疾病特定存活期相關。
    雖然上文實施方式中揭露了本發明的具體實施例，然其並非用以限定本發明，本發明所屬技術領域中具有通常知識者，在不悖離本發明之原理與精神的情形下，當可對其進行各種更動與修飾，因此本發明之保護範圍當以附隨申請專利範圍所界定者為準。
    為讓本發明的上述與其他目的、特徵、優點與實施例能更明顯易懂，所附圖式之說明如下：第1圖的照片為根據本發明一實驗例的西方墨點分析結果；第2圖為長條圖，闡明根據第1圖之實驗例的邊緣細胞群大小；第3圖的照片呈現出根據第1圖之實驗例的腫瘤球體，並以長條圖闡明腫瘤球體的數目；第4圖為根據本發明另一實驗例的西方墨點分析結果；第5圖為長條圖，闡明根據第4圖之實驗例的邊緣細胞群大小；第6圖的照片呈現出根據第4圖之實驗例的腫瘤球體，並以長條圖闡明腫瘤球體的數目；第7圖為長條圖，闡明根據本發明又一實驗例，本方法的偵測極限；第8圖為根據本發明一實驗例，LIN28基因經RQ-PCR反應所得之標準曲線；第9圖闡明屬於不同實驗群組之156名個體的標準化LIN28B表現量；第10圖闡明屬於不同實驗群組之96名肝癌患者的標準化LIN28B表現量；第11圖至第15圖為卡普蘭-梅爾存活折線圖，用以闡明在不同病患子群內，無復發存活期(RFS)與循環系統中存有可表現LIN28B基因之癌細胞之間的關係；以及第16圖為一卡普蘭-梅爾存活折線圖，用以闡明在不同病患子群內，疾病特定存活期(DSS)與LIN28B基因表現量之間的關係。
    <110> 國立成功大學
    <120> 用以偵測循環性癌幹細胞的方法與套組
    <130> P2736-TW
    <150> TW 100140770
    <151> 2011-11-08
    <160> 10
    <170> PatentIn version 3.5
    <210> 1
    <211> 18
    <212> DNA
    <213> 人工序列
    <220>
    <223> 引子
    <400> 1
    <210> 2
    <211> 18
    <212> DNA
    <213> 人工序列
    <220>
    <223> 引子
    <400> 2
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    <212> DNA
    <213> 人工序列
    <220>
    <223> 引子
    <400> 3
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    <211> 22
    <212> DNA
    <213> 人工序列
    <220>
    <223> 引子
    <400> 4
    <210> 5
    <211> 24
    <212> DNA
    <213> 人工序列
    <220>
    <223> 探針
    <400> 5
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    <211> 753
    <212> DNA
    <213> Homo sapiens
    <400> 6
    <210> 7
    <211> 21
    <212> DNA
    <213> 人工序列
    <220>
    <223> shRNA目標序列
    <400> 7
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    <211> 19
    <212> DNA
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    <220>
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    <400> 8
    <210> 9
    <211> 20
    <212> DNA
    <213> 人工序列
    <220>
    <223> 引子
    <400> 9
    <210> 10
    <211> 21
    <212> DNA
    <213> 人工序列
    <220>
    <223> 探針
    <400> 10
    权利要求:
    Claims (21)
    [1] 一種利用一癌幹細胞標記基因來偵測一個體是否帶有偵測循環性癌幹細胞的方法，其中該癌幹細胞標記基因為Lin-28同源物B(LIN28B)基因或其變異型，且其序列與序列編號：6所示序列具有至少80%的核酸序列相似度，包含以下步驟：由該個體取得一體液樣本；由該體液樣本分離出複數個單核細胞；利用一聚合酶連鎖反應式方法來決定該些單核細胞中該癌幹細胞標記基因的表現，其中該癌幹細胞標記基因的表現表示取自該個體之該體液樣本含有循環性癌幹細胞；而缺乏該癌幹細胞標記基因的表現表示取自該個體之該體液樣本含有循環性癌幹細胞。
    [2] 如請求項1所述之方法，其中該個體經診斷患有肝癌，且該方法更包含評估該個體的術後預後，其中當該體液樣本帶有該循環性癌幹細胞時，表示該個體的術後預後較差；且當該體液樣本不帶有該循環性癌幹細胞時，表示該個體的術後預後較佳。
    [3] 如請求項2所述之方法，其中該較佳的術後預後係指一無復發存活期大於等於12個月，且該較差的術後預後係指一無復發存活期小於12個月。
    [4] 如請求項1所述之方法，其中該體液樣本係取自或衍生自以下任一種體液：該個體的周邊血、肋膜腔積液、腹水、腦脊髓液、淋巴液及骨髓液。
    [5] 如請求項1所述之方法，其中該些單核細胞係利用密度梯度分離法而分離出來。
    [6] 如請求項1所述之方法，其中該聚合酶鏈鎖反應式方法為一反轉錄聚合酶鏈鎖反應(RT-PCR)，該RT-PCR使用一如序列編號：1所示之正向引子以及一如序列編號：2所示的反向引子。
    [7] 如請求項1所述之方法，其中該聚合酶鏈鎖反應式方法為一定量即時反轉錄聚合酶鏈鎖反應(RQ-PCR)，該RQ-PCR使用一第一引子對，該第一引子對包含：如序列編號：3所示之正向引子以及一如序列編號：4所示的反向引子。
    [8] 如請求項7所述之方法，其中該RQ-PCR更使用一第一螢光標記探針，其序列如序列編號：5所示。
    [9] 如請求項7所述之方法，其中該RQ-PCR更使用一第二引子對，該第二引子對包含：如序列編號：8所示之正向引子以及一如序列編號：9所示的反向引子。
    [10] 如請求項9所述之方法，其中該RQ-PCR更使用一第二螢光標記探針，其序列如序列編號：10所示。
    [11] 如請求項1所述的方法，其中該聚合酶連鎖反應式方法為一RQ-PCR，其包含：分析該些單核細胞內該癌幹細胞標記基因的表現量，以得到該癌幹細胞標記基因的一循環閾值(CtCSC值)，其中：當該CtCSC值小於38且大於0，表示該些單核細胞內有該癌幹細胞標記基因的表現；以及當該CtCSC值大於等於38或CtCSC值，表示該些單核細胞沒有該循環性癌幹細胞的表現。
    [12] 如請求項11所述之方法，其中該個體經診斷患有肝癌，且該方法更包含：取得該癌幹細胞表現基因的一拷貝數(CpCSC)；分析該些單核細胞內一管家基因的表現量，以得到該管家基因的一拷貝數(CpHK)，其中該；根據方程式(1)計算該癌幹細胞標記基因相對於該管家基因的一相對表現分數：相對表現分數=log(CpCSC/CpHK) 方程式(1)；以及將該相對表現分數與至少一預定門檻值相比較，其中：當該相對表現分數大於等於該預定門檻值時，表示該個體的術後預後較差；以及當該相對表現分數小於該預定門檻值時，表示該個體的術後預後較佳。
    [13] 如請求項12所述之方法，其中該管家基因為編碼β-肌動蛋白或3-磷酸甘油醛脫氫酶的一基因。
    [14] 如請求項13所述之方法，其中該管家基因為該編碼3-磷酸甘油醛脫氫酶的基因，該預定門檻值為-3，且該術後預後為疾病特定存活期。
    [15] 一種用以偵測一個體內循環性癌幹細胞之套組，包含一第一引子對，其能夠專一性地與一癌幹細胞標記基因雜合，其中該癌幹細胞標記基因為LIN28B基因或其變異型，其序列與序列編號：6所示序列具有至少80%的核酸序列相似度；以及該第一引子對包含一正向引子與一反向引子，其分別包含15至30個連續的核苷酸，該些核苷酸與序列編號：6所示序列中的15至30個連續核苷酸相同或互補。
    [16] 如請求項15所述之套組，其中該正向引子的序列如序列編號：1所示，且該反向引子的序列如序列編號：2所示。
    [17] 如請求項15所述之套組，其中該正向引子的序列如序列編號：3所示，且該反向引子的序列如序列編號：4所示。
    [18] 如請求項17所述之套組，更包含一第一螢光標記探針，其序列如序列編號：5所示。
    [19] 如請求項15所述之套組，更包含一第二引子對，其能夠專一性地與一管家基因基因雜合。
    [20] 如請求項19所述之套組，其中該管家基因為編碼3-磷酸甘油醛脫氫酶的基因，且該第二引子對包含一該正向引子其序列如序列編號：8所示，以及一反向引子其序列如序列編號：9所示。
    [21] 如請求項20所述之套組，更包含一第二螢光標記探針，其序列如序列編號：10所示。
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    TW100140770||2011-11-08||
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